Zbiory Działu Historycznego są bardzo różnorodne. Do eksponatów zgromadzonych jeszcze przed wojną należą m.in. militaria pruskie; zbiór starej broni i uzbrojenia uzupełniany był po wojnie i liczy obecnie ponad 300 eksponatów (najstarszy to rzadko spotykany późnośredniowieczny miecz bojowy z początku XVI wieku). Podobnie jeszcze przed 1945 rokiem znalazło się w muzeum wiele przedmiotów związanych ze śląskim rzemiosłem cechowym. Ozdobą kolekcji są skrzynie i lady, tarcze trumienne, sztandary rzemieślnicze, pieczęcie, różnego rodzaju naczynia i narzędzia, w tym okazały strug stolarski z 1726 roku.
Interesujący zbiór stanowią druki i starodruki, m.in. liczne polonika z oficyn śląskich z okresu od XVIII do XX wieku. Pokaźna jest także kolekcja kartograficzna z licznymi mapami Śląska; wśród nich znajduje się unikalna mapa Meriana według Helwiga z 1776 roku. Z zabytków ilustrujących najstarsze dzieje miasta warto wymienić XIV-wieczne i XV-wieczne zworniki z kościoła na Górce i ratusza opolskiego oraz XVI-wieczny dzwon i wagę, pochodzące również z ratusza.
Dział dysponuje bogatym materiałem ikonograficznym dotyczącym Opola, a także innych miejscowości regionu: grafikami, zdjęciami, pocztówkami, rysunkami czy planami. Reprezentatywny jest zespół dokumentów i pamiątek związanych z działalnością dwóch polskich organizacji w okresie międzywojennym: Związku Polaków w Niemczech i Związku Harcerstwa Polskiego w Niemczech. Część cennych obiektów dotyczy również plebiscytu na Górnym Śląsku z 20 marca 1921 roku.
W 2014 roku Muzeum przejęło największą w Polsce prywatną kolekcję trojaków staropolskich, należącą wcześniej do Tadeusza Igera, liczącą 3600 monet. Stanowi ona najważniejszą część kolekcji numizmatycznej Działu, w skład której wchodzi jeszcze około 5000 innych monet, banknotów, medali, plakiet i odznaczeń.
Godne odnotowania są też kolekcje zegarków pochodzących głównie z początku XX wieku, naczyń i utensyliów aptecznych z przełomu XIX i XX wieku, fotografii z najstarszych opolskich atelier, a także pozostających w związku z wyposażeniem kamienicy mieszczańskiej mebli, sprzętów kuchennych, przyborów toaletowych, bibelotów, przedmiotów codziennego użytku z końca XIX i z pierwszej połowy XX wieku.
Dział Historyczny gromadzi również pamiątki związane z powojenną historią Opola. Na szczególną uwagę zasługują zbiory fotograficzne, obiekty związane z osiadłymi po 1945 roku mieszkańcami Opolszczyzny, historią ruchu „solidarnościowego” i wiele innych.
Wybrane eksponaty są prezentowane na wystawach stałych: „Opole – gród, miasto, stolica regionu”, „W kręgu farmacji” oraz w kamienicy czynszowej.